现有的模型细胞可以分为：人原代肝细胞、动物原代肝细胞、永生细胞系、诱导多能干细胞（iPSCs）源性肝细胞样细胞（HLCs）和肝切片。

01人原代肝细胞

优点：人原代肝细胞在较大程度上保留了细胞在体内器官里的功能，各种物质代谢功能和酶活性与体内的肝细胞极其相似，是最为接近临床的一种标准体外短期培养模型。人原代肝细胞通常从肝或肝组织中获得，一般在肝切除手术中或者肝移植后排斥的肝组织中获取，随后即时进行研究或者冻存待用。

具体案例：

人原代肝细胞LO-2(HL-7702)

①细胞培养：

LO-2细胞解冻复苏后，培养在含10%胎牛血清的DMEM－F12培养基中，放置于37℃，含5%二氧化碳的培养箱，待细胞增殖至75%～85%时，常规消化、传代，冻存。

②NAFLD细胞模型的复制：

油酸钠和棕榈酸钠摩尔浓度比2∶1配制脂肪酸母液。使用完全培养基倍数稀释脂肪酸母液，稀释为1.2mmol/L的脂肪酸造模液，用以复制NAFLD细胞模型。

③分组处理：

将LO-2细胞分为正常组、模型组、阳性对照组和实验组。

正常组细胞使用完全培养基培养；

模型组细胞使用1.2mmol/L脂肪酸造模液培养；

阳性对照组细胞使用1.2mmol/L脂肪酸造模液，并加入浓度为192μmol/L的α－LA干预；

实验组细胞使用1.2mmol/L脂肪酸造模液，加入浓度为100mg/L的HPS干预。

各组均干预24h后检测指标。

④模型评价：

油红O染色法观察细胞脂肪变性。

GPO-PAP酶法检测细胞TG含量。

流式细胞术检测细胞凋亡率。

RT-PCR检测细胞GＲP78和SＲEBP-1c基因表达情况。

WB检测细胞GＲP78和SＲEBP-1蛋白表达情况。

02动物原代肝细胞

鉴于人原代肝细胞存在数量稀缺和伦理道德等问题，研究人员尝试从动物肝脏中分离原代肝细胞，用来体外培养并进行研究。使用较多的是啮齿动物。

具体案例：

小鼠正常肝脏细胞（AML12）

①细胞分组：

将AML-12细胞随机分为五组：正常对照组、给药组、PA组、PA＋阳性药预处理组。

另外，对SIRT1进行RNA干扰实验分为五组：正常对照组、PA组、PA＋阳性药物预处理组、PA＋SIRT1siRNA预处理组、PA＋阳性药物＋SIRT1siRNA预处理组。

②细胞培养：

AML-12细胞使用F12培养基（含10％FBS、40ng／L地塞米松、１％Insulin-Transferrin-Selenium（100Ｘ））。恒温培养箱中（37℃、5％二氧化碳饱和湿度），定期换培养液。

③细胞造模：

将PA和BSA混合制成１ｍMPA储备溶液。

为了建立NAFLD的细胞模型，然后将AML-12细胞暴露于200μMPA中24ｈ后给予不同剂量的阳性药物进行治疗。

④模型评价：

检测ALT、AST、TC、TG、MDA水平及SOD活力；

免疫印迹WB；

SIRT1-siRNA转染；

RNA提取及qRT－PCR。

03永生细胞系

常用的永生细胞系有人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞L02、人肝癌细胞系HuH7、人肝癌细胞系HepaRG和人肝星状细胞系LX2等。

不同细胞系的优势与不足

细胞培养方式01单独培养模型

优点：周期短、效率高，有利于高通量药物筛选实验，普遍应用于脂肪肝的研究。

缺点：缺乏维度,没有介质流，只有一种类型的细胞，缺少其他类型的细胞，如枯否氏细胞、星状细胞和巨噬细胞等，缺乏细胞之间的相互作用。

02共培养模型

相关学者建立了一种HepG2细胞与THP-1巨噬细胞共培养的模型，先将巨噬细胞贴壁于无菌载玻片，随后将载玻片放入接种了HepG2细胞的6孔板中，加入浓度为1mmol/L的混合脂肪酸(PA和OA的比例为1:2)，诱导24h后建立了NAFLD模型。

优点：弥补了单独培养模型的不足，培养条件简单，还能进行高通量实验。

缺点：现有的共培养模型种类不多，未来还有很大的发展潜力。

03三维培养模型

三维培养常用的方法有支架培养和悬浮培养这两种。

常用的支架材料有水凝胶、胶原蛋白和层黏连蛋白等，支架可以支撑肝细胞，形成类似细胞间接触和细胞间基质的相互作用。悬浮培养是指细胞在悬浮条件下自发聚集形成球体，这种方法操作简单、费用低、应用广泛。

三维培养还分为三维单细胞培养和三维共培养。

三维共培养模型的缺点是操作复杂和价格昂贵，还需要继续提升技术和完善功能，从而在科研中得到更广泛的利用。

脂肪肝细胞模型所用的细胞类型多种多样，培养的方法也各不相同。每种细胞模型都有自身的优缺点，研究者可根据实验环境、研究目的等因素选择适当的细胞模型对脂肪肝进行研究。

脂肪肝细胞模型的干预条件01高脂诱导

PA和OA是人体中最丰富的膳食长链脂肪酸，是目前NAFLD造模中最常用的脂肪酸，但是脂肪酸存在溶解性差的问题。

为了使其更好地溶解于培养基，一般使脂肪酸与BSA以5:1的比例结合，溶解后再用培养基稀释至所需浓度。

02高糖诱导脂肪肝

有学者使用5~25mmol/L葡萄糖和/或5~25mmol/L果糖在1mmol/L混合脂肪酸(PA和OA浓度比为1:2)存在的条件下诱导HepG2细胞24h，监测脂质和尿酸生成、葡萄糖代谢、氧化状态以及相关基因和蛋白的变化。

结果表明，PA可以诱导胰岛素抵抗、氧化应激和脂质积累，OA促进细胞内脂质积累，而果糖可以促进尿酸和胆固醇的产生，果糖、葡萄糖和脂肪酸协同提高细胞内外TG和细胞外的MDA。

03酒精诱导脂肪肝

相关学者为了探究玉米肽和姜黄素对AFLD的作用时，在HepG2细胞培养基中加入浓度为1mmol/L的OA、玉米肽和姜黄素共同培养20h后，加入0.6%的无水乙醇继续培养4h，建立了AFLD的细胞模型，检测到模型组细胞的ALT、AST和LDH泄漏量显著增多，提示发生细胞损伤；胞内TG、MDA和乙醇脱氢酶含量显著增多，提示细胞内脂质和脂质过氧化产物增多。

综上，高脂、高糖和酒精都可以诱导细胞脂肪变性。一般来说，浓度越高，作用时间越长，诱导脂肪肝的效果越好，但是酒精浓度过高会影响细胞存活率。

不同的细胞系对糖类、脂类、酒精的敏感性也有所不同，研究者需要预先筛选出适当的造模液浓度。

文章出自 动物实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/